化合物の透過性および標的親和性
分解誘導化合物（デグレーダー化合物）の開発において、標的タンパク質およびE3リガーゼに対する細胞透過性と親和性の評価は、効果、選択性、安全性、作用メカニズムの理解に不可欠です。これにより、さまざまな疾患に対するより効果的かつ標的を絞った治療法の開発が可能になります。PROTACの細胞透過性および標的親和性を測定するための、細胞ベースのNanoBRET® Target Engagementアッセイおよび生化学的Lumit®アッセイについてより詳しくご紹介します。
NanoBRET® Target Engagementアッセイを用いた、化合物の細胞透過性およびE3リガーゼへの親和性を定量的に評価する手法についてご説明します。
PROTAC の細胞透過性および標的タンパク質との親和性は ?
細胞ベースのアプローチ
デグレーダー化合物の開発においては、標的タンパク質およびE3リガーゼに対する細胞透過性と親和性の評価が重要です。NanoBRET® Target Engagement (TE) Assays は、生細胞内におけるタンパク質と低分子化合物の結合相互作用を測定することができ、化合物の透過性、標的親和性、レジデンスタイム（滞留時間）を定量的に評価する手段を提供します。
プロメガでは創薬において重要な複数の標的クラス、例えばキナーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）、ブロモドメインに対して、NanoBRET®™ TE technologyを用いたアッセイの開発に成功しています。最近では、この技術をE3リガーゼに応用し、CRBN、VHL、XIAP、cIAP、MDM2に対するNanoBRET® TEアッセイも開発されました。NanoBRET® TE E3 Ligase Assaysは、生細胞または透過処理を施した細胞のいずれでも実施可能であり、E3リガーゼに対する化合物の親和性と細胞透過性の両方を評価することができます。
Principle of the NanoBRET® Target Engagement Assay
NanoBRET® TE Assay を用いた BRD4 を標的とした BET 分解誘導剤の細胞内親和性の測定. BRD4 NanoBRET® TE assay を用いてBRD4（左パネル）を標的とした2つの PROTAC の細胞内親和性を比較した。測定した結合親和性に対する化合物の細胞透過性の影響を評価するために、E3 リガーゼ CRBN に対する分解誘導剤の親和性をNanoBRET® TE CRBN assayを用いて生細胞および透過処理済み細胞で比較した（右パネル）。この実験では dBET6 の細胞透過性が dBET1 よりも高く、dBET1 に比べCRBN に対するdBET6 の親和性もわずかに高いことを明らかにした。
View E3 ligase assays for CRBN and VHL or contact us for other assays (e.g., XIAP, cIAP and MDM2).
細胞内の利用可能量の定量化
NanoBRET® TE技術により、観察されたポテンシーの変化から化合物の細胞内利用可能量を評価することが可能です。さらに、この結合ポテンシーの相対的な変化を正規化することで、コントロール化合物と比較した複数の化合物の相対的な細胞内利用可能量を定量的に評価することができます。
生化学的アプローチ
プロメガでは小分子とE3リガーゼとの二者間相互作用をモニタリングするための生化学的手法も提供しています。さらに、これらの手法は、小分子と標的タンパク質との相互作用の測定にも対応しています。ここに示す例では、モレキュラーグルーとセレブロン複合体との相互作用を検出しています。
小分子と標的タンパク質との相互作用を測定するための生化学的アプローチの概略図
モレキュラーグルーとセレブロン複合体との相互作用 モレキュラーグルーの相対的な親和性を評価するために、それらをセレブロン-サリドマイドトレーサー複合体に滴定しました。トレーサーが競合的に置換されることで、発光シグナルが減少します。相対的なIC50値は、溶解細胞内でのターゲットエンゲージメントアッセイの結果と相関します。
Lumit®テクノロジーを用いた、E3リガーゼおよび標的タンパク質との結合を研究する抗体ベースのアプローチについて詳細は ポスターダウンロードまたはお問合せ.
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