標的タンパク質の分解
タンパク質分解誘導化合物の機能に関する定量的解析は、創薬と開発に有益であるだけでなく、細胞プロセスの理解を深めることで、より効果的かつ標的を絞った治療法の開発を可能にし、生物学および疾患の理解を前進させます。HiBiT テクノロジーは、タンパク質分解の高感度かつリアルタイムの定量化を可能にし、ハイスループットスクリーニングや解析において強力なツールとなります。
CRISPRノックイン細胞株およびクローンを用いたリアルタイムのタンパク質分解研究については、下記の資料をご覧ください。
標的タンパク質は分解されているのか ?
HiBiTテクノロジーは、タンパク質分解機能の定量分析を可能にします。HiBiTは11アミノ酸のペプチドタグで、その相補的パートナーであるLgBiTに対して高い親和性を有しています。一緒に、それらはバイナリ発光タンパク質であるNanoBiT®ルシフェラーゼを構成します。CRISPR ゲノム編集技術により内在性の遺伝子座にHiBiTを導入すると、HiBiT と LgBiT の結合により再形成されたルシフェラーゼタンパク質の非常に明るい光により内在性レベルの標的タンパク質を高感度に検出することができます。
分解誘導性化合物を添加すると、発光シグナルの消失を非常に定量的、リアルタイムに測定することができます。細胞の用量反応曲線は24〜48時間の時間枠で取得およびモニタリングできるため、分解率、Dmax、DC50値、タンパク質回収率を正確に決定できます。
このアプローチにより、一連の異なる分解パラメーターに対する迅速な順位付けが可能になり、ハイスループットスクリーニングも可能です。
The HiBiT protein tagging system accommodates lytic, extracellular and intracellular live-cell detection.
PROTAC処理後の内因性HiBiT-BRD4の分解動態 HiBiTは、 HEK293 LgBiT Cell Lineの内因性BRD4遺伝子座に挿入されています。細胞は、Nano-Glo® Endurazine™基質を含むCO₂非依存培地中でMZ1の段階希釈処理を行いました。パネルA：ルミネッセンスの経時変化、パネルB：分解速度、パネルC：最大分解率（Dmax）。
CRISPR ノックイン細胞株およびクローンを用いたリアルタイムでのタンパク質分解研究
HiBiT Knock-In Degradation Workflow
Both endpoint and live-cell analysis start with a cell line expressing the HiBiT-POI fusion, typically generated through CRISPR/Cas9 knock-in of the HiBiT tag to study the target protein under endogenous expression conditions.
Endpoint analysis of HiBiT-tagged protein levels provides a quantitative, high-throughput compatible method for determining degrader compound efficacy. Generation of cellular dose–response curves can be used to calculate DC50 and Dmax values and assess both on-target efficacy and off-target degradation.
Live-cell kinetic analysis of HiBiT-tagged protein levels is performed with intracellular expression of LgBiT. ViaScript® LgBiT mRNA Delivery System allows for rapid uniform expression of intracellular LgBiT across a variety of cell lines. Luminescence is detected in real-time using Nano-Glo® Extended Live Cell Substrates and may be monitored on the GloMax® Discover instrument. The resulting data can be analyzed to derive quantitative compound parameters, such as degradation rate and duration at Dmax, using the Pronect™ TPD Kinetic App.
ターゲットはネイティブな細胞の細胞内で分解されているか？
Lumit® 細胞イムノアッセイによる標的タンパク質分解のモニタリング
PROTAC処理後のネイティブSMARCA4の分解 各ウェルに50,000個の細胞を播種した。指定された化合物で処理後、Lumit® イムノアッセイ細胞システム（セット2）を用いてSMARCA4のレベルを検出しました。パネルA：250nMのACBI-1、250nMのACBI-1および20µMのMG132、250nMのCis-ACBI-1、またはDMSOで5時間処理した後のSMARCA4レベル。パネルB：3種類の細胞株におけるACBI-1によるSMARCA4分解プロファイリング。パネルC：ACBI-1によるSMARCA4分解のタイムコース。
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