標的タンパク質のユビキチン化
ターゲットタンパク質のユビキチン化のカイネティクスを把握することは、PROTACやモレキュラーグルーといったタンパク質分解誘導化合物の開発において非常に重要です。NanoBRET®ユビキチン化アッセイおよび生化学的Lumit®免疫アッセイは、ターゲットタンパク質のユビキチン化をモニタリングするための効率的な方法です。
抗体ベースのアプローチによるターゲットタンパク質のユビキチン化を研究手法について、詳細は下記アプリケーションノートをご覧ください。
標的タンパク質はユビキチン化されているか ?
細胞ベースのアプローチ
NanoBRET® テクノロジーは、標的タンパク質ユビキチン化のカイネティクス測定や化合物の用量反応曲線測定などのアプリケーションに利用することができます。
NanoBRET® ユビキチン化 アッセイでは、標的タンパク質はエネルギードナーとして機能させるために、外来性の一過性 NanoLuc® 融合タンパク質として細胞内で発現、あるいは LgBiT 発現細胞で内在性の HiBiTタグ融合タンパク質として発現させます。また、HaloTag-Ub 融合タンパク質はエネルギーアクセプターとして外来性に発現させます。エンドポイントまたはカイネテック分析によりリアルタイムで 生細胞 NanoBRET® アッセイを行います。ユビキチン化の変化は、三重複合体形成と同様に通常 化合物添加後 1- 4 時間以内に観察されます。
NanoBRET-ユビキチン複合体の概要.
BRD4 ユビキチン化 カイネティクスのモニタリング. CRISPR/Cas9 ゲノム編集を用いて HEK293 LgBiT Cell Line の 内在性 BRD4 遺伝子座に HiBiTを挿入した。この安定クローンに HaloTag®-Ubiquitin アクセプタープラスミドをトランスフェクションした。細胞は1μM MZ1 または 1μM dBET1 で処理し、経時的に標的タンパク質のユビキチン化を NanoBRET™ Nano-Glo® Kinetic Detection Reagent を用いて測定した。
PROTAC 処理後 BRD4 ユビキチン化の生細胞エンドポイントアッセイ. HEK293 細胞にNanoLuc®-BRD4 および HaloTag®-ユビキチンプラスミドを 1：100 のドナー：アクセプター比でトランスフェクトし、HaloTag® NanoBRET™ 618 Ligand の存在下で再播種し、dBET1または MZ1 PROTAC 化合物の 10μM 希釈系列で1時間 処理した。両方の PROTACについて、BRET比の用量依存的な増加が観察された。エラーバーは標準偏差を表す (n = 3) 。
Antibody-based assay for PROTAC活性に対する抗体ベースのアッセイ. 内在性にタグ付けされたHiBiT-BETファミリーを含み、LgBiTを発現するHEK293細胞に対し、指定された時間に1 μMのdBET1またはMZ1 PROTACを処理した。細胞はジギトニンで溶解し、NanoBRET®比を測定するために、一次抗体であるポリクローナル抗ユビキチン抗体と、蛍光標識されたAlexa Fluor® 594二次抗体の両方と10分間インキュベートした。データは、t = 0の時点に正規化したNanoBRET®値の増加倍率として示し、ばらつきは、n = 3の実験から得られたSEM（標準誤差）として表した。
生化学的アプローチ
プロメガは、標的タンパク質のユビキチン化を検出する生化学的な手法も提供しています。下記の例ではLumit® Immunoassay テクノロジーを使用したE3リガーゼのCb-bのユビキチン化を検出しています。
標的タンパク質のユビキチン化モニタリングのための生化学的アプローチの概略図 必要なユビキチン化構成要素であるE1、E2およびATPの存在下で、Lumit® Immunoassayはビオチン化ユビキチンとGST-Cbl-bの相互作用を測定できます。
Cbl-bの自己ユビキチン化の測定 Panel A. ATP存在下でのCbl-b-GSTのユビキチン化は濃度依存的に増加により、発光シグナルも増加します。このプロセスはATP依存的であるため、ATP不在の場合はシグナルは低くバックグラウンドレベルになります。Panel B. 非標識ユビキチンの希釈系列を用いてビオチン化ユビキチンとの競合を行ったところ、濃度依存的な発光シグナルの低下が観察されました。
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