RealTime Glo Annexin V Apoptosis Assay

アポトーシスの進行をリアルタイムでモニタリング

RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay はアポトーシスの過程で細胞膜の外側に露出されるホスファチジルセリン (PS) をリアルタイムで測定することができます。本アッセイ試薬に含まれるアネキシン V - ルシフェラーゼ融合タンパク質が初期アポトーシスで細胞表面に現れるPSに結合すると発光シグナルが検出されます。また、本試薬には細胞膜の完全性が損なわれると細胞内のDNAに結合し蛍光シグナルを生じる色素も含まれます。

発光と蛍光シグナルの組合わせとタイミングは、後期アポトーシスで起こる２次ネクローシスと他の細胞毒性イベントにより起こるネクローシスとを見分けるために利用することができます。

このアッセイは細胞を溶解せず、簡便な "添加 - 測定" だけの方法なので1つのアッセイウェルより複数回にわたり測定を行うことができます。何枚ものプレート、複雑な工程、特殊な検出装置を必要とせずにアポトーシスをリアルタイムでモニタリングすることができます。定量には発光と蛍光を検出できるマルチモードリーダーのみが必要です。

また、発光顕微鏡を用いてイメージングを行うこともできます（LV200を用いたAnnexin Vの発光イメージング*）。

*U2OS細胞にスタウロスポリン（終濃度1uM）を添加し、アポトーシスを誘導した。LV200（Olympus）にてイメージングを行い、Annexin Vの発光（Blue）とネクローシスの蛍光（Green）の像を重ねあわせた。＜オリンパス社秋吉様のご厚意によりデータ提供＞

アッセイの原理

NanoLuc® Binary Technology (NanoBiT) がベースとなる Realtime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay は NanoLuc® ルシフェラーゼの相補的な2つのドメインを含むアネキシン V 融合タンパク質 (Annexin V-LgBiT および Annexin V-SmBiT) を利用します。これらが互いに近づくと LgBiT と SmBiT ドメインが会合して機能を有する NanoLuc® を形成します。

健全な細胞

Annexin V-LgBiT および Annexin V-SmBiT (NanoBiT) 融合タンパク質を含む検出試薬と DNA結合性蛍光色素

14332MA-W-a Annexin V protein NanoBit fusions are bound to phosphatidylserine

初期アポトーシス

PS の露出によりアネキシン融合タンパク質同士が近接して機能性 NanoLuc® が形成されるまで発光レベルは低く抑えられる。

14332MA-W-b Phosphatidylserine rafts on the apoptotic cell surface bind Annexin V

２次ネクローシス

アポトーシス後期に細胞膜の完全性が失われると細胞内に DNA 結合性蛍光色素が入り込み蛍光シグナルが増加。

14332MA-W-c Membrane rupture in secondary necrosis is indicated by fluorescence

RealTime Glo Annexin V Apoptosis Assay

テスト化合物への暴露後に同一サンプルウェルより繰り返し発光と蛍光を測定することにより、刺激による細胞毒性効果およびその作用機序を同時に調べることができます。この図では PS: アネキシン V 結合と細胞膜の損傷の時間差がアポトーシスのフェノタイプから2次ネクローシスへの移行状態を示しています。

Annexin V binding and loss of membrane integrity was captured on the GloMax Galaxy repeatedly from the same sample well after exposure to a test compound allows resolution of the effects of cytotoxic stimuli and determination of mechanism of action.

1種類の試薬を加えて繰返し測定するだけ

異なる濃度、複数のタイムポイントを 1プレートで測定

リアルタイムアッセイなら化合物による処理中、同一ウェルより発光および蛍光を繰返し測定できるため、従来のエンドポイントアッセイよりも少ないプレート数、試薬量で化合物の有効性を決定することができます。

本試薬は様々な培養細胞タイプに適応し、処理前に添加することも化合物と同時に添加してリアルタイムで測定し、アポトーシスの過程を経時的に追跡することもできます。

RealTime-Glo™ Apoptosis Assay

複数のデータポイントを１液添加、1アッセイプレートで

Apoptosis progression in single well with annexin V assay 14344ma-w-a — Data for each dose was obtained at multiple time points using a single assay plate with one reagent addition.

エンドポイントアッセイ

複数のデータポイントを複数のアッセイプレートで

Endpoint Assays vs RealTime Apoptosis Assays — Here, 7 plates were needed to obtain the data that could be achieved using a single plate with the real-time assay.

詳細データ: このデータの詳細および様々な細胞モデルで RealTime Apoptosis Assay を用いて実施した安全性試験あるいは暴露試験についてはSOT 2017 で発表した技術ポスター "A Real-Time, Bioluminescent Annexin V Assay for the Assessment of Apoptosis" をご覧ください。

ポスターをダウンロード

フローサイトメトリーによる検出した蛍光アネキシン結合法と一致した結果

本実験では K562 細胞を様々な濃度のボルテゾミブに16時間暴露した。

上パネル: 細胞を採取、洗浄した後にAlexa Fluor® 488 (緑色蛍光, PtdSer:AnxV 結合) および 7-AAD (赤色蛍光, 細胞膜の完全性) で標識し、フローサイトメトリー（10,000 イベント）により分析した。

下パネル: K562 細胞 (10,000/ウェル) を RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay reagent 存在下で段階希釈したボルテゾミブに暴露した。発光 (PtdSer:AnxV 結合) および蛍光 (細胞膜の完全性) を動力学的に記録した。ボルテゾミブで16時間インキュベーションした細胞のデータ。

詳細データ: このデータはどのようにリアルタイム法で異なる細胞死モードを分離して測定できるかを示しています。詳細についてはAACR 2017 で発表した技術ポスター "A Real-Time, Plate -based Annexin V Method for Monitoring Programmed Cell Death" をご覧ください。

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ネクローシス検出試薬とのセット品または単品から選べます

RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay
(Cat.# JA1011 and JA1012)

細胞非透過性の蛍光 DNA 結合色素を含むネクローシス検出試薬を含みます。細胞膜の完全性が失われると色素が細胞内に入りDNA に結合して蛍光シグナルを生じます。

RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay
(Cat.# JA1000 and JA1001)

ネクローシス検出試薬は含まれません。ネクローシス用の検出マーカーの無いアッセイを行うことはできますが、細胞膜の完全性を失った細胞死を検出することはできません。カタログ番号 JA1000 または JA1001 を使用する場合は CellTox™ Green (カタログ番号 G8742) などの細胞毒性検出試薬を用いて完全なアッセイ機能と明瞭なデータを取得することを推奨します。

Customer Testimonial

Challenge:
Grant Harradence, manager of the Bioassay Department at Abzena, oversees successful implementation of cytotoxicity assays to identify promising lead candidates. He and his team needed more data per assay to better understand bioconjugates mode of action and kinetics. End-point assays were too limiting and time-consuming.

Result:
The team integrated RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis Assay to their workflow with no challenging optimizations, and were able to capture more information with fewer assays.

Their workflow also includes CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay for cell viability. The expanded data available to their clients and partners has helped them strengthen their collaborative research relationships.

プロトコール

Complete Protocol

RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay Technical ManualPDF (2555 KB) – English

選択製品の構成品内容

Item	Part #	Size
Annexin V-SmBiT Reagent (1,000X)	J700A	1 × 25μl
CaCl₂ (1,000X)	J750A	1 × 250μl
Annexin V-LgBiT Reagent (1,000X)	J800A	1 × 25μl
Annexin V NanoBiT® Substrate, 1,000X	JA100A	1 × 25μl
Necrosis Detection Reagent, 1,000X	JA101A	1 × 25μl

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For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

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U.S. Pat. No. 8,809,529, European Pat. No. 2635582, Japanese Pat. No. 5889910 and other patents and patents pending.

U.S. Pat. Nos. 8,598,198 and 9,458,499 and other patents and patents pending.

U.S. Pat. Nos. 9,797,889, 9,797,890 and 11,493,504; European Pat. No. 2970412; Japanese Pat. Nos. 7280842 and 7532562; and other patents pending.

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Annexin V-LgBiT Reagent (1,000X)	J800B	1 × 250μl
Annexin V NanoBiT® Substrate, 1,000X	JA100B	1 × 250μl
Necrosis Detection Reagent, 1,000X	JA101B	1 × 250μl

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Annexin V-LgBiT Reagent (1,000X)	J800A	1 × 25μl
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技術資料

RealTime Glo Annexin V Apoptosis Assay

Part Numbers: JA1011, JA1012, JA1000, JA1001

シンプルなプレートベースのリアルタイム アポトーシス検出システム

アポトーシスの進行をリアルタイムでモニタリング

アッセイの原理

健全な細胞

初期アポトーシス

２次ネクローシス

RealTime Glo Annexin V Apoptosis Assay

1種類の試薬を加えて繰返し測定するだけ

RealTime-Glo™ Apoptosis Assay

エンドポイントアッセイ

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技術記事

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