ADP-Glo™ Kinase Assay with Lipid Kinase Substrates

ホスファチジルイノシトール(PI)およびそのリン酸化型はホスホイノシチド と総称され、シグナル伝達分子として重要なセカンドメッセンジャーであり、細胞膜のリモデリングにも深く関与しています。これらはホスファチジルイノシトール脂質キナーゼ(PIKs)ファミリーによりリン酸化されます。哺乳動物では19種類PIKアイソフォームが同定されています。また、イノシトール環の3位,4位,5位の水酸基の選択的なリン酸化能により大きく3つのファミリー（ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ;PI3K、ホスファチジルイノシトール4-キナーゼ;PI4K、ホスファチジルイノシトールリン酸キナーゼ;PIP5K,PIP4K）に分類されています。

プロメガの脂質キナーゼ酵素、基質および検出システムは、PIK反応およびADP-Glo™ Kinase Assay（発光ADP検出プラットフォーム）を利用したキナーゼ活性測定用の完全な試薬セットを提供します。試薬にはクラスIのPI3K(精製したヒト組み換えタンパク質)、最適化された反応バッファー、すぐに使用可能な脂質キナーゼ基質が含まれます。PI3K-Glo™ Class I Profiling KitにはPI3K(α,β,γおよびδ;各5μg)、PIP2:3PS Lipid Kinase Substrate (0.25mg) および ADP-Glo™ Kinase Assay（1,000回分）などで構成され、酵素は単品でご購入いただけます。基質となる脂質は、ホスファチジルイノシトール(PI)またはホスホイノシトール-4,5-ビスホスフェイト(PIP2)がキャリア脂質としてのホスファチジルセリン(PS)と1：3の比率で混和されたミクスチャーを含む凍結した単層の小胞として供給されます。PIP2とPSが1:3で混和された基質はクラスIのPI3Kで使用するために最適化されています。またPIとPSが1:3で混ざった基質は主要なファミリーメンバーに認識されることが示されており、ユニバーサルなPI脂質キナーゼ基質として供給されます。

脂質キナーゼアッセイの原理を以下の図に示します。脂質キナーゼ反応は、脂質基質(PI:3PSまたはPIP2:3PS)とリコンビナント酵素およびATPをインキュベーションすることにより実施され、キナーゼ活性はADP-Glo™ Kinase Assayを用いて測定されます。ADP-Glo™ Kinase Assayは2ステップで完了します。キナーゼ反応後に脂質キナーゼ反応を停止させ、残存するATPを枯渇させADPのみにするためにATP-depletion reagentを添加します。次にADPからATPへの変換と、新しく生成したATPを光に変換するためのルシフェラーゼ/ルシフェリン反応を同時に行うdetection reagentを添加します。

• クラスI PI3Kのための完全なソリューション：
  -高い比活性を有する精製ヒト組み換え酵素
  -Ready-to-useな脂質基質（PI or PIP2）
  -ユニバーサルな反応バッファー組成
  -高感度なアッセイシステム
• 優れた選択性：基質の変換率（％）が低くでも高いシグナル/バックグラウンド比。    
• 信頼の結果：広いダイナミックレンジ、低バックグラウンド、優れた感度により明瞭なデータが得られます。
• 時間の節約：シンプルな“添加&測定”フォーマットによるホモジニアスアッセイ。
• 偽陽性を低減：特殊な組成および発光シグナルにより偽陽性率が低減。
• コストセーブ：1,536-ウェルフォーマットに変更できウェルあたりのコストを低減。

【カルタヘナ】対象品（V1690, V1721, V1731, V1741, V1751, V1761, V1771） 

1. Cantley, L.C. (2002) The phosphoinositide 3-kinase pathway. Science 296, 1655–7.
2. Markman, B. et al. (2010) Status of PI3K inhibition and biomarker development in cancer therapeutics. Annals Oncology 21, 683–91.
3. Brown, J.R. and Auger, K.R. (2011) Phylogenomics of phosphoinositide lipid kinases: perspectives on the evolution of second messenger signaling and drug discovery. BMC Evolutionary Biology 11, 1–34.
4. Hawkins, P.T. et al. (2006) Signalling through Class I PI3Ks in mammalian cells. Biochem. Soc. Trans. 14, 647–62.