Non-Radioactive Phosphatase Assay Systems

Non-Radioactive Protein Phosphatase Assaysは、細胞および組織ホモジネートや精製酵素分画を用いて、セリン/スレオニンあるいはチロシンホスファターゼ活性を迅速に定量するためのシステムです（PP1は検出しません）。本システムの非放射性アッセイでは、リン酸化ペプチド基質から遊離されるリン酸をモリブデン酸：マラカイトグリーン：リン酸複合体に変換し、96ウェルプレートリーダーまたは分光光度計を用いて600nm～630nmの波長で測定します（1-3）。様々なバッファー条件での使用が可能で、基質として自然にリン酸化されたタンパク質や添付される特異性の広いリン酸化合成ペプチドなどを使用できます。
本アッセイでは、遊離リン酸100pmolから4000pmolの範囲で直線性が得られます。Serine/Threonine Phosphatase Assay Systemにはいくつかのセリン／スレオニンホスファターゼ（Ppase2A,2B,2C）の基質になる化学合成したリン酸化ペプチド,RRA(pT)VAが添付されます（PP1の基質としては適しません）。また、Tyrosine Phosphatase Assay Systemには2つの化学合成したリン酸化ペプチドEND(pY)INASL（4）およびDADE(pY)LIPQQG（5）が添付されており、多くのプロテインチロシンホスファターゼの基質として機能します。粗精製/精製酵素の測定に加え、クルードな細胞/組織抽出液からでもホスファターゼ活性を測定することができます。このようなアプリケーションの場合、アッセイの前に添付のSpin Columnを用いて高濃度のリン酸をサンプルから取り除きます。このカラムは迅速、効率的に遊離リン酸やその他の低分子量阻害剤を除去することができます。さらに、Molybdate Dye Solutionによる酸性条件が原因となるタンパク質の沈殿を、ユニークなMolybdate Dye Additiveを組合わせることにより回避することができます。

•迅速：30分でアッセイ結果が得られます。

•簡便性：添付される試薬はそのまま使用できます；サンプル調製溶液から遊離リン酸を除去するためのカラムが付属します。

•正確性：アッセイにおける基質濃度および有効範囲は、一般的なホスファターゼ（+基質）のVmax、Km値に適応。

•非放射性：基質の放射性標識が不要なため、放射性廃棄物も生じません。また、添付されるリン酸化基質は6ヶ月間安定（適切に保存した場合）。

さらに知りたい方は プロトコール＆ガイド（英語）をご覧ください。

Use with Purified Samples or Crude Cell and Tissue Extracts

In addition to measuring phosphatase activity in partially fractionated and purified samples, the Phosphatase Assay Systems can measure phosphatase activity in crude cell or tissue extracts. For this application, the high concentration of phosphate in these preparations is eliminated prior to performing the assay using the supplied Spin Columns, which rapidly and effectively remove free phosphate and other low-molecular-weight inhibitors from the sample. In addition, a unique Molybdate Dye Additive that is combined with the Molybdate Dye Solution aids in the solubilization of proteins exposed to the acid conditions of the Molybdate Dye Solution, which alone could potentially cause precipitation of the proteins.