UDP-Glo™ Glycosyltransferase Assay

UDP-Glo™ Glycosyltransferase Assayはドナー基質としてUDP-糖を使用して産物としてUDPを遊離させるグリコシルトランスフェラーゼ活性を検出するための発光アッセイです。グリコシルトランスフェラーゼにより触媒されるグリコシル化反応は、細胞間の相互作用、細胞内シグナリング、細菌の細胞壁の生合成など多くの生物学的プロセスで 中心的な役割を果たしています。グリコシルトランスフェラーゼはグリコシル供与体ヌクレオチド（例.：UDP-ガラクトース、UDP-グルコース、UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc、UDP-グルクロン酸)からアクセプター分子に糖を転移させます。グリコシルトランスフェラーゼ反応では、UDP部分が産物として遊離されるため、UDPを検出するアッセイはグリコシルトランスフェラーゼの多くの活性モニタリングに適しています。

UDP-Glo™ Glycosyltransferase Assayは1種類の試薬を加えるだけのホモジニアスアッセイで、グリコシルトランスフェラーゼ反応でUDPの産生を迅速に検出するための方法です。グリコシルトランスフェラーゼ反応後、等量のUDP Detection Reagentを添加して、UDP産物からATPへの変換とルシフェラーゼ反応での発光を同時に行います。生成した発光はルミノメーターで測定します。この発光はUDPスタンダードカーブを用いることでUDP濃度を算出することができます。

このアッセイは、ドナー基質としてUDP-糖を使用して精製されたグリコシルトランスフェラーゼの使用を前提としており、細胞や細胞抽出液を用いたアッセイはできません。しかし、免疫沈降法や親和性タグによるプルダウンにより細胞抽出液よりグリコシルトランスフェラーゼを精製することができ、それをUDP-Glo™ Glycosyltransferase Assayに使用することはできます。

• ユニバーサルアッセイ：あらゆるUDP-糖を利用するグリコシルトランスフェラーゼおよびグリコトランスフェラーゼ：基質（ペプチド、タンパク質、脂質、糖質）の組み合わせを利用可能。
• 高いダイナミックレンジ：低濃度のUDPでも高いシグナル/バックグラウンド比を示すため、グリコシルトランスフェラーゼ反応に要する酵素量を低減可能。
• 高感度：UDP 0.1–0.5pmolを検出（バックグラウンドの2倍以上のシグナルで）。
• nM-µMレンジでの直線性：低濃度のUDP-糖によりグリコシルトランスフェラーゼの阻害を低減。
• 信頼性があり再現性のあるデータ：低いUDP生成スピードでも通常Z値＞0.7
• 発光ベースのUDP検出：化合物により干渉が低減。
• バッチプレート処理：3時間後でも80％以上のシグナルを維持する長時間発光。

• 異なる糖に対するグリコシルトランスフェラーゼの特異性プロファイリング
• グリコトランスフェラーゼ活性への影響に関する化合物ライブラリーのスクリーニング
• 薬剤開発における化合物のグルクロン酸化検出

1. Haltiwanger, R.S. and Lowe, J.B. (2004) Role of glycosylation in development. Annu. Rev. Biochem. 73, 491–537.

The assay response is linear in the nanomolar to micromolar range, allowing use of low concentrations of UDP-sugar, and alleviating issues due to feedback glycosyltransferase inhibition.

The data to the left shows the linearity and sensitivity of the UDP-Glo™ Glycosyltransferase Assay. Here, a UDP standard curve was prepared over the indicated range of UDP concentrations in 25µl of 1X glycosyltransferase reaction buffer in a solid white 96-well plate. UDP-Glo™ Glycosyltransferase Assay was performed using 25µl of UDP Detection Reagent at room temperature. Luminescence was recorded using a GloMax® luminometer. Values represent the mean of four replicates. The table shows luminescence measured 1 hour after adding the UDP Detection Reagent, and signal-to-background ratios calculated for each concentration of the UDP standard curve.