レポーターアッセイ

レポーターアッセイは、生物学的応答を簡便に測定するための手法として広く使用されています。利用可能なレポーター遺伝子には、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなど、さまざまな種類があります。中でもルシフェラーゼは、発光量を測定することで検出可能な、高定量性・高感度・広いダイナミックレンジを持つ生物発光レポーターアッセイの構築に用いられています。生物発光は、ルシフェラーゼ酵素と発光基質との反応によって光を発生させる現象であり、複数の発光クラスが存在します。遺伝子レポーター用途で広く使用されているルシフェラーゼには、甲虫由来のルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼを含む）、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ、そして深海性エビ由来のルシフェラーゼを改変したNanoLuc®ルシフェラーゼなどがあります。

ルシフェラーゼレポーターアッセイを構築するには、ルシフェラーゼの遺伝子レポーターを細胞内に導入します。導入方法としては、一過性発現または安定発現のいずれかが一般的です。細胞内のルシフェラーゼ活性は、通常、界面活性剤を含むバッファー溶液を加えて細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質を添加して発光反応を開始することで定量されます。この方法では、1サンプルあたり10～20モル、あるいはそれ以下のルシフェラーゼ量でも検出可能であり、これはおおよそ1細胞あたり約10分子程度に相当します。そのため、ルシフェラーゼアッセイは、広い直線的ダイナミックレンジをもつ定量手法として非常に優れています。分泌型ルシフェラーゼを使用する場合は、培養上清をサンプリングし、別プレートでアッセイを実行することで発光を測定できます。また、NanoLuc®やウミシイタケルシフェラーゼなど一部の細胞内ルシフェラーゼは、細胞を溶解せずにそのまま検出できるため、細胞応答の動態をリアルタイムで測定するライブセル型レポーターアッセイとしても利用可能です。

多くのレポーター遺伝子アッセイでは、1つまたは2つのレポーター遺伝子が使用されます。2つのレポーターを用いる場合、一般的に2つ目のレポーターは「コントロール」ベクターから発現され、実験系のレポーターの結果を正規化するために用いられます。たとえば、2つ目のレポーターは細胞数のばらつきやトランスフェクション効率の違いを補正する目的で用いられます。通常、コントロールレポーター遺伝子は構成的プロモーターによって発現され、「実験系」のベクターと一緒にコトランスフェクションされます。コントロールベクターと実験ベクターでは異なるレポーター遺伝子を使用することで、それぞれのレポーター活性を個別に測定することが可能になります。ご自身の研究ニーズに合った最適なレポーターアッセイの選択については、レポーターアッセイ選択ガイドをご覧ください。