Dual-Luciferase® Reporter Assay System

デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイとは何ですか？

デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイは、同じ細胞溶解液から、通常はホタルおよびRenillaという2種類のルシフェラーゼ酵素の活性を測定する方法です。ホタルルシフェラーゼレポーターは、実験対象となる遺伝子制御を反映します。Renillaルシフェラーゼは、補正用の内部コントロールとして使用します。トランスフェクション効率、細胞数、細胞溶解のばらつきを補正できるため、シングルレポーターアッセイより正確で再現性の高い結果が得られます。

Renillaルシフェラーゼを内部コントロールとして使用する理由は何ですか？

Renillaルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼのD-luciferinとは異なる基質であるcoelenterazineを使用します。このため、2つの反応は互いに干渉せず、同じサンプルから連続して測定できます。弱い構成的プロモーターでRenillaルシフェラーゼを発現させた場合、その発現量は実験条件によって変化しにくいため、サンプル間のトランスフェクション効率や細胞数を補正する基準として適しています。

ホタルルシフェラーゼアッセイでは、luciferin、ATP、O₂からどのように光が生じますか？

ホタルルシフェラーゼは、2段階の反応によって基質D-luciferinの酸化を触媒します。最初の段階では、ATPによってluciferinがアデニル化され、luciferyl-AMPが生成されます。次の段階では、分子状酸素によってluciferyl-AMPが酸化され、電子励起状態のoxyluciferinが生成されます。Oxyluciferinが基底状態へ戻る際に光子を放出します。この発光量は、広い濃度範囲にわたってルシフェラーゼ活性に比例します。

DLR™ Assayには専用のルミノメーターが必要ですか？

はい。DLR™ Assayはフラッシュ型の反応を利用するため、試薬添加からシグナル測定までのタイミングを一定に保つには、2基の試薬オートインジェクターを備えたルミノメーターが必要です。プロメガのDLReady™プログラムでは、DLR™ Assay Systemでの使用が検証されたルミノメーターを紹介しています。インジェクターを使用しないワークフローには、発光半減期が約2時間の安定したグロー型反応を採用したDual-Glo® Luciferase Assay System（カタログ番号E2920/E2940/E2980）をご検討ください。Dual-Glo® assayは、オートインジェクターを必要とせず、発光測定に対応した一般的なプレートリーダーで使用できます。96および384ウェルプレートのバッチ処理に最適化されています。

DLR™ Assayの直線的な検出範囲はどの程度ですか？

DLR™ Assayは、ホタルおよびRenillaルシフェラーゼ活性のいずれについても、7桁の範囲で直線性を示します。GloMax® Discoverのように広いダイナミックレンジを持つ高感度ルミノメーターを使用した場合、アトモル（<10⁻¹⁸ mol）レベルの感度が得られます。この広いダイナミックレンジにより、小さなシグナル変化を検出できるだけでなく、高活性サンプルでも測定前の希釈が必要になることはほとんどありません。

デュアルルシフェラーゼとシングルレポーターは、どのように使い分けますか？

サンプル間でトランスフェクション効率または細胞生存率にばらつきがある場合は、DLR™ Assayを使用してください。こうしたばらつきは、多くの細胞ベースレポーター実験で生じます。Renillaルシフェラーゼ活性で補正することで、このノイズを低減し、データの信頼性を高めることができます。

ウェル間のばらつきを低減するには、どうすればよいですか？

1. 各サンプルのホタルルシフェラーゼ活性をRenillaルシフェラーゼ活性で補正
2. 細胞播種密度とトランスフェクション条件の統一
3. 細胞溶解および試薬添加へのマルチチャンネルピペットまたはリキッドハンドラーの使用
4. すべての試薬の室温への平衡化
5. 手作業による測定タイミングのばらつきを抑える、オートインジェクター搭載DLReady™ルミノメーターの使用

DLR™ Assayは無細胞系で使用できますか？

はい。DLR™ Assay Systemは、 TNT® Coupled Reticulocyte Lysate Systemsなどの無細胞転写・翻訳反応に対応しています。細胞へトランスフェクションすることなく、規定された環境で遺伝子発現とその制御を研究できます。合成生物学、ハイスループットスクリーニング、機能解析などに有用です。

内部コントロールとして使用する場合、NanoLuc®とRenillaルシフェラーゼにはどのような違いがありますか？

同じプロモーターから発現させた場合、NanoLuc®ルシフェラーゼはRenillaルシフェラーゼより最大1,000倍明るい発光を示します。Nano-Glo® Dual-Luciferase Reporter Assay System（カタログ番号 N1610）では、ペアとなるレポーターの一方にNanoLuc®ルシフェラーゼを使用します。レポーター発現量が非常に低い場合や、補正比を有効なダイナミックレンジ内に維持するために、より明るいコントロールシグナルが必要な場合に有用です。

再現性の高い結果を得るため、アッセイ条件をどのように最適化しますか？

ルシフェラーゼアッセイの性能は、測定前および測定時の複数の要因による影響を受けます。これらを系統的に管理することが、ばらつきの少ない高品質なデータを得るために重要です。

細胞密度とトランスフェクション

• 均一なコンフルエンシーを得るため、トランスフェクションの18～24時間前に一定の密度で細胞を播種し、トランスフェクション時のコンフルエンシーを約70～80％に調整
• すべての実験で同じロットのトランスフェクション試薬と、同じDNA：試薬比を使用。DLR™ Assayプロトコルで検証済みのFuGENE® HD Transfection Reagent
• 補正を行うため、一定のDNA比率でのRenillaコントロールベクター（pRL-TK、pRL-CMVなど）の使用。通常、ホタルルシフェラーゼコンストラクトに対して1：10～1：50。Renillaシグナルが直線範囲内に十分収まるよう比率を調整

細胞溶解

• 1X濃度のPassive Lysis Buffer（PLB）の使用と、希釈後の凍結融解の回避
• 96ウェルプレートの接着細胞では、1ウェル当たり20µlの1X PLBを標準使用量として使用。24ウェルプレートでは100µlなど、ウェルサイズに応じた比例増量
• 十分な細胞溶解のため、室温で15分間のプレート振とう。不完全な細胞溶解は、大きなばらつきの一般的な原因
• 直ちに測定しない場合の－70°Cでの細胞溶解液の凍結保存。DLR™ Assayは凍結した細胞溶解液に対応

測定条件

• デュアルオートインジェクターを搭載したDLReady™認証ルミノメーターの使用。注入量10～100µl、試薬添加後の遅延時間2秒、測定積算時間10秒に最適化されたアッセイ
• 使用前に試薬を室温へ平衡化。低温のLAR II Reagentによるシグナル強度の低下
• 使用直前にLAR IIおよびStop & Glo® Reagentを調製または融解し、混合済み試薬の繰り返しの凍結融解を回避
• 全ウェルで測定タイミングを統一するため、LAR II添加後5分以内のホタルルシフェラーゼ測定と、Stop & Glo®添加後30秒以内のRenillaルシフェラーゼ測定

データの補正と直線範囲

• 各サンプルについて「ホタルルシフェラーゼRLU ÷ RenillaルシフェラーゼRLU」で補正済みレポーター活性を算出し、ネガティブコントロール（空ベクターまたは溶媒処理細胞）に対する変化倍率として表示
• ホタルルシフェラーゼシグナルがルミノメーターの直線範囲を超える場合（一般に ≥10⁶ RLU）、細胞溶解液を1X PLBで10倍希釈して再測定。DLR™ Assayは7桁の直線範囲を持つため、通常の発現条件では希釈が必要になることはまれ
• Renillaコントロールシグナルが直線範囲内にあることの確認。過剰なpRLベクターDNAによるRenillaコントロールの過剰発現は、補正に使用できるダイナミックレンジを狭める可能性
• アッセイバックグラウンドを確認するDNAなしトランスフェクションコントロール（Mock）と、ロット間の一貫性を確認する既知活性のポジティブコントロールコンストラクトの使用

デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイでは何を研究できますか？

DLR™ Assay Systemは、ライフサイエンス分野の論文で広く引用されているレポーター遺伝子解析ツールです。高感度、広い直線範囲、内部補正機能を備え、さまざまな遺伝子制御研究に利用できます。

• プロモーターおよびエンハンサー活性：推定制御配列をホタルルシフェラーゼレポーターの上流へクローニングし、刺激、変異、共発現させた転写因子に対する転写活性を定量
• シグナル伝達経路の活性化：CRE、NF-κB、AP-1、Wnt／TCFなどの経路応答性プロモーター配列をホタルルシフェラーゼの上流に配置し、特定のシグナル伝達経路を活性化または阻害する化合物や遺伝子改変をスクリーニング
• 転写因子の結合および活性：転写因子の結合配列を持つレポーターベクターと転写因子コンストラクトを共トランスフェクションし、転写活性化能を測定
• 3′ UTR制御およびmiRNA活性：ホタルルシフェラーゼコード配列の下流に3′ UTR配列を挿入し、miRNA、RNA結合タンパク質、その他のUTR配列による転写後制御を解析
• siRNAおよびshRNAの検証：標的遺伝子のプロモーターで発現させたレポーター活性、または標的遺伝子の3′ UTRに連結したレポーター活性の低下を測定し、RNA干渉コンストラクトのノックダウン効率を確認
• ウイルスプロモーターおよび複製研究：ウイルスLTRまたはプロモーターをホタルルシフェラーゼの上流へクローニングし、共トランスフェクションしたRenillaコンストラクトで補正しながら、ウイルス遺伝子発現または複製活性をモニタリング
• 無細胞転写・翻訳： in vitro転写・翻訳反応における、細胞へのトランスフェクションを必要としない規定環境下での遺伝子発現および制御の研究