ONE-Glo™ + Tox Assayはルシフェラーゼレポーターアッセイと細胞生存性マーカー測定を組み合わせたアッセイで、細胞の健全性を考慮に入れることでレポーター遺伝子発現をより正確に理解することができます。本アッセイは試薬を添加する2ステップの操作だけで完了し、プレートの同一ウェル内で2つのアッセイが完結するため、各アッセイを別々/並行に実施する必要がありません。
アッセイの第一段階では、実験処理後の培養細胞群における生細胞の相対数を非溶解性の蛍光アッセイ（CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay）で測定します。CellTiter-Fluor™ Assayは、生細胞内に常在するプロテアーゼ活性を細胞生存性マーカーとして測定します。細胞透過性の蛍光基質 (glycylphenylalanyl-aminofluorocoumarin; GF-AFC) がインタクトな細胞に入り込むと生細胞プロテアーゼにより切断され、生細胞数に比例した蛍光シグナルを生成します。この生細胞プロテアーゼは細胞膜の完全性が失われ培地中に漏出すると不活性化されます。遊離したAFC蛍光物質の蛍光はマイクロプレートリーダーやCCDイメージャー（励起波長：380–400nm、蛍光波長：505nm） で測定します。
アッセイの第二段階では、発現したホタルルシフェラーゼ酵素の測定にONE-Glo™ Luciferase Assay Systemを用います。
このシステムに含まれるONE-Glo™ Luciferase Assay Buffer および ONE-Glo™ Luciferase Assay Substrateを混和して ONE-Glo™ Reagentを調製します。 ハイスループットあるいはウルトラハイスループットなアプリケーションに対応するために新規なfluoroluciferin substrateが採用されており、試薬の安定性が向上し、サンプルに含まれる成分に対する耐性が得られます。また、標準的なルシフェラーゼアッセイ試薬よりも硫黄臭が抑えられています。発光はマイクロプレートリーダーやCCDイメージャーで測定します。
また、恒常的な発現プロモーターを有するホタルルシフェラーゼレポーターベクターを使用することでタンパク質の発現効率と細胞生存性を加味したトランスフェクション条件の最適化にも利用することができます。
- 効率的：細胞生存性とルシフェラーゼ遺伝子発現を同一アッセイウェル内で測定。単一ウェル内の細胞で複数項目のデータ取得。
- より生物学的な情報を取得：細胞生存性を背景としたレポーター遺伝子発現の理解
- 簡便：アッセイはシンプルで連続的な“添加-混和-測定”フォーマットを採用
- 高い柔軟性と容易な自動化：各アッセイ試薬の容量はサンプル処理量に合わせてスケールを変更でき、最大1536ウェルフォーマットまで自動化可能
- Niles, A.L. et al. (2007) A homogeneous assay to measure live and dead cells in the same sample by detecting different protease markers. Anal. Biochem. 366, 197–206.
Step 1: Cell Viability Assay
In the first part of the assay, a nonlytic fluorescence-based method (CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay) is used to measure the relative number of live cells in culture. The CellTiter-Fluor™ Assay measures a conserved and constitutive protease activity within living cells. This live-cell protease activity is restricted to intact viable cells and is measured using a fluorogenic, cell-permeant peptide substrate (glycylphenylalanyl-aminofluorocoumarin; GF-AFC). The substrate enters intact cells where it is cleaved by the live-cell protease to generate a fluorescent signal proportional to the number of living cells. The live-cell protease becomes inactive upon loss of cell membrane integrity and leakage into the surrounding culture medium. Fluorescence of the free AFC fluorophore is measured with a microplate reader or CCD imager using an excitation wavelength of 380–400nm and emission wavelength of 505nm.
Step 2: ONE-Glo™ Luciferase Assay
The second part of the assay uses the ONE-Glo™ Luciferase Assay System to quantify firefly luciferase gene expression from cells expressing the reporter. Ideally suited for high- and ultrahigh-throughput applications, the ONE-Glo™ Assay Reagent contains a fluoroluciferin substrate that gives increased stability and greater tolerance of sample components, and has less odor than standard luciferase assay reagents. Luminescence is measured with a microplate reader or CCD imager.
Reference
Niles, A.L. et al. (2007) A homogeneous assay to measure live and dead cells in the same sample by detecting different protease markers. Anal. Biochem. 366, 197–206.