AccuMAP® Low pH Protein Digestion Kit
Suppress Artificial Deamidation and Disulfide Bond Scrambling in Protein Sample Prep
- Sample preparation completed in 4.5–5 hours
- Highly reproducible digestion results
- Use for reduced and nonreduced proteins
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Catalog Number: VA1040
Catalog Number: VA1050
タンパク質サンプル調製中に起こる非酵素的な修飾を抑制
非酵素的な翻訳後修飾 (PTM) は、生物製剤などのタンパク質の製造あるいは保存中に自然発生的に起こります。主な非酵素的な PTM として脱アミド、ジスルフィド結合スクランブリングおよび酸化などがあります。これらの修飾は生物製剤などの効能や安定性に影響を与える可能性があり、注意深くモニタリングすべき項目です。
非酵素的な PTM はペプチドマッピングを行う際のタンパク質サンプル調製でも起こり、分析に影響を与える可能性があります。主な原因としてサンプル調製中のアルカリ性 PHやタンパク質に対する酸化活性を有する添加剤や不純物などが挙げられます。
人為的 PTM の抑制
AccuMAP® Low pH Protein Digestion Kit では還元または非還元条件下、低 pH でサンプル調製を行うことにより人為的な非酵素的修飾を抑制します。
AccuMAP® Low pH Protein Digestion Kitを用いたサンプル調整の模式図
低 pHでのタンパク質消化
ペプチドマッピングのためのサンプル調製で汎用されるトリプシンやその他のプロテアーゼは、タンパク質の消化効率を増加させるためにアルカリ性の pH で反応させます。このような条件下での非酵素的な PTM を避けるために、プロメガは低い pHで行うトリプシン消化法を開発しました。トリプシンによるリジン残基での消化を補完させるために低 pH 耐性の組換え Lys-C (rLys-C) プロテアーゼを追加しました。低 pH 耐性 rLys-C で補完したトリプシンにより低 pHにおける効率的なトリプシン消化を実現しました。
改良トリプシンおよびAccuMAP® Low pH Resistant rLys-Cを用いた低pH条件での効率的な消化。リツキシマブは、従来のプロトコル（pH 8）または AccuMAP® Low pH Protein Digestion Kit を用いた低pH条件で消化され、LC/MS により解析されました。データは、低pHでの消化が従来条件での消化と同等であることを示しています。
脱アミドとジスルフィド結合スクランブリングの抑制
AccuMAP® Low pH Protein Digestion Kit を用いた IgG 消化における脱アミド化およびジスルフィド結合スクランブリングの完全な抑制。
図は、リツキシマブ抗体から得られたペプチド GLEWIGAIYPGNGDTSYNQK の抽出イオンクロマトグラムを示しており、従来条件（pH 8）での消化と、AccuMAP® Low pH Protein Digestion Kit を用いた低pH条件での消化を比較しています。上段のパネルは脱アミド化の抑制を示し、下段のパネルはジスルフィド結合スクランブリングの完全な抑制を示しています。
トリプシン消化における最小限のベースラインノイズ
パニツムマブ消化物のUV-HPLCクロマトグラム。パニツムマブはまずAccuMAP® Low pH Resistant rLys-Cで前消化され、その後反応液を希釈し、トリプシンとともに3時間（上段）または一晩（下段）インキュベーションすることで消化を完了させた。この実験では、トリプシンとタンパク質の比率を1:5で使用した。下段のクロマトグラムに示されているように、一晩消化ではベースラインノイズの蓄積が確認される。
"レミケード" とそのバイオシミラー "レムシマ" の比較研究
2016 年 4月、FDA はレミケード (インフリキシマブ, ヤンセン) の バイオシミラー モノクローナル抗体 "レムシマ (Remsima)" を承認しました。バイオシミラーは患者にとってコストを大きく抑えることができる一方、画期的な薬と安価な複製物との潜在的な違いによる有用性への疑問があるのも事実です。著者によるネイティブ質量分析法（イオンモビリティー & 定量ペプチドマッピング；プロメガの Low pH Protein Digestion Kit も使用） によるレミケードとレムシマの比較に関する文献については以下をご覧ください。
A Multidimensional Analytical Comparison of Remicade and the Biosimilar Remsima. Pisupati, et al. (2017) ACS Anal. Chem. 89, 4838.
"レミケード" とそのバイオシミラー "レムシマ" の比較研究
2016 年 4月、FDA はレミケード (インフリキシマブ, ヤンセン) の バイオシミラー モノクローナル抗体 "レムシマ (Remsima)" を承認しました。バイオシミラーは患者にとってコストを大きく抑えることができる一方、画期的な薬と安価な複製物との潜在的な違いによる有用性への疑問があるのも事実です。著者によるネイティブ質量分析法（イオンモビリティー & 定量ペプチドマッピング；プロメガの Low pH Protein Digestion Kit も使用） によるレミケードとレムシマの比較に関する文献については以下をご覧ください。
A Multidimensional Analytical Comparison of Remicade and the Biosimilar Remsima. Pisupati, et al. (2017) ACS Anal. Chem. 89, 4838.
The AccuMAP® Kit contains all the reagents needed for enzymatic digestion and still offers enough flexibility to adjust to the needs of each particular project. Besides, owing to the low pH conditions, no artifacts (such as deamidation or oxidation) are detected in LC-MS analysis. It is today our first choice for peptide mapping studies, especially for multiple attribute monitoring approaches.
Dr. Claire Butré, R&D Technical Leader, Quality Assistance S.A.
Protocols
Complete Protocol
Specifications
Catalog Number:
選択製品の構成品内容
| Item | Part # | Size | Concentration | Available Separately |
|---|---|---|---|---|
AccuMAP® Modified Trypsin Solution |
V528C | 2 × 60μg | 0.5μg/μl | View Product |
AccuMAP® Denaturing Solution |
VA100A | 1 × 1ml | View Product | |
AccuMAP® 10X Low pH Reaction Buffer |
VA101A | 1 × 1ml | View Product | |
AccuMAP® 100X Oxidation Suppressant |
VA102A | 1 × 50μl | View Product | |
AccuMAP® Low pH Resistant rLys-C Solution |
VA103A | 2 × 60μg | 200μg/ml | View Product |
TCEP |
VB100A | 3 × 15mg | View Product | |
Iodoacetamide |
VB101A | 3 × 15mg | View Product | |
NEM |
VB102A | 2 × 15mg |
選択製品の構成品内容
| Item | Part # | Size | Concentration | Available Separately |
|---|---|---|---|---|
AccuMAP® Modified Trypsin Solution |
V528D | 3 × 400μg | View Product | |
AccuMAP® Denaturing Solution |
VA100B | 2 × 5ml | View Product | |
AccuMAP® 10X Low pH Reaction Buffer |
VA101B | 2 × 5ml | View Product | |
AccuMAP® 100X Oxidation Suppressant |
VA102B | 2 × 250μl | View Product | |
AccuMAP® Low pH Resistant rLys-C Solution |
VA103B | 5 × 240μg | 200μg/ml | View Product |
TCEP |
VB100A | 5 × 15mg | View Product | |
Iodoacetamide |
VB101A | 5 × 15mg | View Product | |
NEM |
VB102A | 4 × 15mg |
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