pGEM®-T Easy Vector Systems

青色コロニーにインサートが含まれていることはありますか？

はい、まれにあります。インサートが非常に小さい場合（通常は約100bp未満）や、lacZαのリーディングフレームとインフレームになる場合、挿入があってもαペプチドが機能を維持し、コロニーが青色になることがあります。これは一般的ではありませんが、特に短いPCRアンプリコンでは起こり得ます。そのため、青/白選択はスクリーニングの補助であり、確定結果ではありません。青色コロニー数が予想より多い場合は、白色コロニーに加えて青色コロニーも一部ピックアップし、すべてコロニーPCRで確認してください。

白色コロニーはすべて正しいインサートを含んでいますか？

いいえ。白色コロニーはlacZαが破壊されたことを示しますが、インサートの同一性を確認するものではありません。よくある偽陽性には、プライマーダイマーのライゲーション産物、非特異的PCR増幅産物、偶発的にlacZαを破壊するベクターの自己ライゲーションなどがあります。白色コロニーは必ず、挿入部位を挟むプライマー（pUC/M13 fwd/rev；Q5601/Q5401）を用いたコロニーPCRで確認し、その後シーケンシングにより配列の同一性と向きを確認してください。

pGEM®-T Easyライゲーションに適したインサート：ベクターのモル比は？

pGEM®-T Easy Vector Systemsは、Control Insert DNAとベクターのモル比1：1で最適化されていますが、8：1～1：8の比率でも成功例があります。新しいPCR産物を扱う場合は、3：1～1：3を初期条件として検討するとよいでしょう。必要なインサート量は、以下の式で計算できます。

インサート量（ng）＝（ベクター量（ng）× インサートサイズ（kb）÷ ベクターサイズ（kb））× インサート：ベクターモル比

例：pGEM®-T Easy Vector（3,015bp）50ngに対し、0.5kbのPCR産物を3：1のインサート：ベクター比で使用する場合、必要なインサート量は？

（50ng × 0.5kb ÷ 3.015kb）× 3 ＝ 約25ngのインサート

1：1の比率では、同じインサートに必要な量は約8.3ngです。BioMath Calculator を使用すると、この計算を自動で行えます。

TAクローニングではなく平滑末端クローニングを使用すべき場合は？

以下の場合は、平滑末端クローニングが適しています。

• PCRプライマーにより、方向性クローニングが可能な相補的制限酵素部位がインサート配列にすでに導入されている場合
• 特定のリーディングフレームを必要とする発現ベクターへクローニングする場合
• 挿入接合部における高忠実度な配列精度が必要で、A付加によって望ましくない配列コンテキストが生じる場合

TAクローニングは迅速で、必要な酵素反応ステップも少ない方法ですが、インサートの向きは制御できません。方向性を持って挿入する必要がある場合は、両端に制限酵素部位を持つプライマーを設計し、配列確認後にサブクローニングしてください。

2X Rapid Ligation Bufferにより迅速なライゲーションが可能になる理由は？

従来のT4 DNAライゲーションバッファーでは、単一塩基突出末端の効率的なライゲーションに、通常4°Cで一晩のインキュベーションが必要です。pGEM®-T Easyに付属する2X Rapid Ligation Bufferは、PEGを含む最適化された組成により、室温1時間でのライゲーションを可能にします (テクニカルマニュアル#TM042より)。PEGは分子クラウディング剤として働き、DNA末端の有効局所濃度を高めることで、室温でもライゲーション反応を大きく促進します。

テクニカルマニュアル#TM042に記載されている重要な取り扱い上の注意：

• バッファー中のATPは温度変化により分解します。1回使用分に分注し、凍結融解の繰り返しを避けてください。ライゲーション効率が低い場合は、新しいバイアルを使用してください。
• 2Xバッファーを希釈しないでください。PEG濃度が重要です。PEGによりバッファーが粘性を示したり相分離して見えたりする場合があるため、使用前に毎回しっかりボルテックスしてください。

pGEM®-T Easy System IとSystem IIの違いは？

System I（カタログ番号A1360）には、pGEM®-T Easy Vector、Control Insert DNA、2X Rapid Ligation Buffer、T4 DNA Ligaseが含まれており、ライゲーションに必要な構成品が揃っています。System II（カタログ番号A1380）には、System Iのすべての構成品に加えて、JM109 High Efficiency Competent Cellsが6本含まれています。ラボでコンピテントセルを用意していない場合に適した、オールインワンのシステムです。JM109細胞は、α相補性に必要なlacZΔM15欠失を持つため、青/白選択に推奨される宿主株です。

pGEM®-T Easyシステムに付属のT4 DNA Ligaseを使用する必要がある理由は？

pGEM®-TおよびpGEM®-T Easy Vector Systemsに付属するT4 DNA Ligaseは、エキソヌクレアーゼ活性が最小限であることを確認したうえで選択されています。他社製のT4 DNA Ligaseには、ベクターのT突出末端から3′末端のチミジン残基を除去するエキソヌクレアーゼが混入している場合があります。その場合、Tベクターが平滑末端分子に変換され、インサートなしで再環状化し、ライゲーション反応後に主に青色コロニーが生じる可能性があります。必ずキットに含まれるT4 DNA Ligaseを使用し、他のシステムのリガーゼで代用しないでください。

Q5やPhusionなどの高忠実度ポリメラーゼで作製したPCR産物をTAクローニングできますか？

直接はできませんが、追加ステップを1つ行えば可能です。Pfu、Q5、Phusionなどの高忠実度校正ポリメラーゼは3′→5′エキソヌクレアーゼ活性を持ち、平滑末端PCR産物を生成します。この産物には、TAクローニングに必要な3′-A突出末端がありません。これらの産物をpGEM®-T Easy Vectorにクローニングするには、まずA付加ステップを行ってください。精製した平滑末端産物をTaq DNA PolymeraseおよびdATPとともにインキュベートし（70°C、15～30分）、3′-A突出末端を付加してから、通常どおりライゲーションします。A付加の前にPCR産物を精製し、残存する校正ポリメラーゼが付加したAを除去したり、ベクターのT突出末端を削ったりしないようにしてください。