NanoLuc® Luciferase

NanoLuc®ルシフェラーゼは、深海のエビから派生した小さく（19.1kDa）非常に安定した酵素であり、発光レポーターとして最適な性能を発揮するように設計されています。この酵素は、新しい基質であるフリマジンを使用して、ホタル（Photinus pyralis）やウミシイタケ（Renilla reniformis）のルシフェラーゼよりも約100倍明るい高強度のグロータイプの発光を生み出します。発光反応はATP非依存であり、アッセイ感度を最大限にするためにバックグラウンドの発光を抑制するように設計されています。従来の遺伝子レポーターとしての用途のみならず、NanoLuc®ルシフェラーゼの小さく極めて明るいという特長はタンパク質融合パートナーとして理想的であり、生細胞におけるタンパク質ダイナミクスの研究への有用性を拡大させました。

NanoLuc® Binary Technology（NanoBiT）は、NanoLuc®ルシフェラーゼに基づく構造補完性レポーターシステムです。これは、最適化されたLgBiTサブユニット（18kDa）と、LgBiTに対してさまざまな親和性を持つことができる小さな11アミノ酸補完性ペプチドサブユニットで構成されています。低親和性の補完性ペプチドはSmBiTと呼ばれます。細胞内タンパク質間相互作用の研究において、LgBiTおよびSmBiTサブユニットを研究対象のタンパク質に融合して細胞内で発現します。2つのタンパク質が相互作用すると、サブユニットが会合して活性化NanoBiT®酵素を形成し、Nano-Glo®基質の存在下で明るい発光シグナルを生成します。この技術により、高感度および特異性で生細胞内のリアルタイムタンパク質間相互作用の研究が可能になります。

低親和性のLgBiTおよびSmBiTサブユニットは、さらに免疫検出用に適応され、 Lumit® イムノアッセイが開発されました。NanoBiT®技術のこの構成では、抗体はLgBiTおよびSmBiTサブユニットで化学的に標識されます。これら標識された抗体が検査対象に結合すると、SmBiTとLgBiTが近接し、活性化NanoBiT®ルシフェラーゼを形成し、Lumit®検出試薬の存在下で発光シグナルを生成します。Lumit®イムノアッセイは、従来のELISAアッセイにとって代わる簡便な手法であり、洗浄ステップが少なく、サイトカインやグルカゴンなどのポピュラーな標的に対して直接、間接、競合的結合フォーマットで開発されており、DIYソリューションもあります。

LgBiTサブユニットは、高親和性の小さなサブユニットであるHiBiTによって補完され、 HiBiTタンパク質タギングシステムを作成することもできます。この技術の構成では、LgBiTとHiBiTが自発的に相互作用して明るいNanoBiT®酵素を再構成します。HiBiTは定量可能なタンパク質タグとして使用でき、従来のクローニング法で導入したり、CRISPR-Cas9遺伝子編集により内因性の遺伝子座に導入されます。HiBiTタグ融合タンパク質は、LgBiTを含む検出試薬で検出できます。また、LgBiTサブユニットを共発現する生細胞内で検出するか、高感度な抗HiBiTモノクローナル抗体を直接使用することもできます。HiBiTタンパク質タギングシステムは、内在性レベルの発現量の低いタンパク質を正確に検出するための、高感度でシンプル、柔軟なタンパク質検出法です。

NanoBRET®テクノロジーは、生きた細胞内でのタンパク質：タンパク質の相互作用や化合物のターゲットエンゲージメントを測定するために使用される、生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）ベースの方法です。NanoLuc®ルシフェラーゼはその明るく青色にシフトした放射スペクトルのため、BRETエネルギードナーとして最適です。NanoBRET®タンパク質：タンパク質相互作用アッセイでは、一方のタンパク質パートナーがNanoLuc®ルシフェラーゼ融合タンパク質として発現します。もう一方のタンパク質はHaloTag®融合タンパク質として発現し、細胞透過性のNanoBRET® 618蛍光物質で標識されます。明るく青色にシフトしたドナーシグナルと赤色にシフトしたアクセプターにより最適なスペクトルオーバーラップが生み出され、従来のBRETアッセイと比較してシグナルが増加し、バックグラウンドが低減します。ポピュラーなターゲットに対する構築済みアッセイ、DIYシステム、およびカスタムNanoBRET® PPI開発サービスが利用可能です。

NanoBRET®テクノロジーは、生細胞内での化合物結合アッセイにも適用でき、 NanoBRET®ターゲットエンゲージメント（TE）と呼ばれています。このアッセイ形式では、ターゲットタンパク質はNanoLuc®ルシフェラーゼ融合体として細胞内で発現させます。次に標的タンパク質に可逆的に結合する細胞透過性の蛍光NanoBRET®トレーサーを添加します。蛍光トレーサーがNanoLuc®融合タンパク質に結合することでエネルギー転移とBRETシグナルが生じます。標的タンパク質に結合するテスト化合物はトレーサーと競合し、NanoBRET®シグナルの消失を引き起こすため、細胞内での化合物との親和性を定量的に測定することが可能です。NanoBRET® TEは、占有率、化合物選択性、細胞内化合物の利用可能性、および化合物の滞留時間の測定にも使用できます。近年のNanoBRET® TEの構成では、再構成されたNanoBiT®ルシフェラーゼをエネルギードナーとして使用し、細胞内タンパク質複合体でのターゲットエンゲージメントの研究が可能です。構築済みのアッセイは、340以上のキナーゼを含む主要な薬物ターゲットに対して利用可能です。DIYツールやカスタム開発、細胞キナーゼ選択性プロファイリングサービスも提供されています。