NanoBRET® ターゲットエンゲージメント

標的タンパク質は、NanoLuc®ルシフェラーゼとの融合タンパク質として発現させます。そこに、標的タンパク質に可逆的に結合する細胞透過性の蛍光NanoBRET®トレーサーを添加します。ライブセル内で蛍光トレーサーが標的-NanoLuc®融合タンパク質に結合すると、NanoLuc®ルシフェラーゼとの近接により、BRETシグナルが発生します。テスト化合物が標的タンパク質に結合する場合、トレーサーと競合することでNanoBRET®シグナルが減少します。

NanoBRET® TEアッセイは、化合物の細胞内到達性（intracellular availability）を評価するために使用できます。このパラメーターは、細胞膜透過性の指標として機能します。この評価は、NanoBRET® TEアッセイを2つのモード（ライブセルモード／膜透過処理済みセルモード）で実施することで行います。ライブセルモードでは、細胞膜がそのまま保持されており、化合物が標的にアクセスするのを阻害する可能性がある状態で見かけの細胞内親和性を測定します。一方、膜透過処理済みセルモードでは、細胞膜によるバリアが除去されており、化合物と標的の本来の親和性（固有親和性）を測定できます。この2つのモードで得られた親和性データを比較することで、細胞内到達性を定量的に計算することができます。

化合物間で細胞内到達性を比較できるように、膜透過性を有する標準化合物がコントロールとして使用され、正規化が行われます。これにより、「Availability Index（AI）」と呼ばれるパラメーターを計算することができ、複数の化合物間で相対的な細胞内到達性を比較することが可能になります。AI値が小さいほど、その化合物は細胞内に到達しやすいことを示します。化合物間での細胞内到達性の比較は、透過性に関わる物理化学的特性に基づいて候補化合物の優先順位を付ける手段として有用です。この評価は、PROTACs（高分子量化合物）のような細胞透過性が課題となる薬剤候補の開発において、特に重要な役割を果たします。

NanoBRET®ターゲットエンゲージメントテクノロジーは、キナーゼ、HDAC、ブロモドメイン、GPCRなど、さまざまなクラスの標的タンパク質に適用可能です。ご興味のあるターゲットに対応したNanoBRET® TEアッセイが存在しない場合は、ご自身で開発することも可能です！NanoBRET® TEアッセイの開発は、以下の3つのステージで構成されます。

1. 標的タンパク質に結合可能な蛍光トレーサー候補を合成します。NanoBRET® 590蛍光色素は、新規NanoBRET®トレーサーの作製に最適です。
2. NanoLuc®ルシフェラーゼと標的タンパク質を融合させた発現ベクターを作製します。使用するベクターは、Flexi®ベクターシステム対応ベクターまたはマルチクローニングサイトを有するベクターを有するベクターのいずれかから選択できます。
3. NanoBRET® TEアッセイにおけるトレーサー候補の性能を評価します。対象の標的が細胞内タンパク質である場合は、Intracellular TE Nano-Glo® Substrate/Inhibitor が必要です。本製品に含まれるコンポーネントにより、測定されるBRETシグナルが細胞内相互作用に由来することを保証します。

さらに詳しくは、NanoBRET® 590 Dye の製品ページをご覧ください。