三重複合体の形成
標的タンパク質、分解誘導化合物、E3リガーゼからなるE3三者複合体の形成は、標的タンパク質分解における重要なステップです。この過程は、効果的なデグレーダー化合物の開発および最適化における重要な指標となります。三者複合体の形成を測定するための、細胞ベースのNanoBRET®アッセイおよび生化学的Lumit®アッセイについてご紹介します。
Lumit®テクノロジーを用いた抗体ベースの三者複合体形成モニタリング手法に関するポスターをご覧ください。
PROTAC は3重複合体を形成しているのか ?
細胞ベースのアプローチ
NanoBRET® technologyは、生細胞フォーマットにおける三者複合体形成の研究に最適であり、エンドポイント解析および動態解析の両方に対応しています。
このアッセイでは、標的タンパク質がエネルギー供与体（生物発光）として機能し、細胞内で外因性の一過性NanoLuc®融合タンパク質、またはLgBiT発現細胞における内因性タグ付きHiBiT融合タンパク質として発現されます。von Hippel-Lindau（VHL）またはセレブロン（CRBN）E3リガーゼ成分と融合したHaloTag®は外因的に発現させ、蛍光リガンドで標識されてエネルギー受容体として機能します。
NanoBRET™ 三重複合体の形成の概要
生細胞エンドポイント法による PROTAC 誘導性 BRD4 VHL/CRBN 三重複合体形成 および BRD4 タンパク質レベルのマルチプレックス検出. NanoLuc®-BRD4 ドナープラスミドと HaloTag®-VHL または HaloTag®-CRBN アクセプタープラスミドを 1:100 の比率でトランスフェクトしたBRD4/VHL アッセイ用の細胞を MG132 (またはDMSO コントロール) 、続いて 1µM MZ1 (VHL-based PROTAC) または DMSO で処理した。NanoBRET™ 比率は PROTAC 処理による三重複合体の形成を示し（パネル A）、NanoLuc® の発光は標的タンパク質レベル（パネル B）を示す。
PROTAC 処理後のBRD4/VHL 3重複合体形成のカイネテックなモニタリング. CRISPR/Cas9 ゲノム編集を用いて HEK293 LgBiT Cell Line の内在性 BRD4 遺伝子座にHiBiTを挿入した。この安定発現クローンに HaloTag®-VHL アクセプタープラスミドをトランスフェクトし、PROTAC 処理の前に MG132 による前処理を施した。NanoBRET™ シグナルは NanoBRET™ Nano-Glo® Kinetic Detection System を用いて測定し、リアルタイムで三重複合体の形成をモニタリングした。
生化学的アプローチ
プロメガでは、さまざまなE3リガーゼ、標的タンパク質、PROTACにおける三重複合体形成をモニタリングするための生化学的手法も提供しています。以下の例では、Lumit® Anti-Tag タンパク質相互作用試薬を用いて、セレブロンおよびVHL複合体とのPROTACを介した三者複合体形成を測定しています。
三重複合体形成をモニタリングするための生化学的アプローチの概略図 標的タンパク質としてBRD3（BD2）を用いた場合、抗FLAG-LgBiTおよび抗GST-SmBiTのLumit®試薬を使用して、PROTACを介した三重複合体形成をモニタリングすることができます。
Lumit® Anti-Tagタンパク質相互作用試薬は、異なるPROTACの相対的な活性を評価可能 Panel A. Tセレブロン複合体＋BRD3（BD2）とdBET1またはdBET6との三重複合体形成。 Panel B. VHL複合体＋BRD3（BD2）とARV-771またはMZ1との三重複合体形成。これらのアッセイにより、dBET6がdBET1よりも高い活性を示すこと、またARV-771とMZ1は類似した活性を示すことが明らかになりました。いずれの系においても、高濃度のPROTACで特有のフック効果が観察されました。
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