HaloPROTAC3

Part Numbers: GA3110, GA4110

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HaloTag®融合タンパク質を標的とする低分子分解誘導剤

  • 特異的で制御されたタンパク質分解
  • HaloTag®蛍光リガンドを用いれば、 FACS®で CRISPR /Cas9 HaloTag® ノックイン細胞を濃縮可能
  • HaloTag® 融合体にHiBiTを追加すれば、タンパク質分解を簡単・定量的に発光検出可能

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選択製品のカタログ番号: GA3110

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HaloPROTAC3
HaloPROTAC3/20µl
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創薬困難あるいは挑戦的なターゲットのための低分子分解誘導剤

HaloPROTAC3は、生細胞内の HaloTag融合タンパク質に特異的に結合する低分子の分解誘導剤であり、標的特異的な PROTACは 標的化の困難なタンパク質の分解を研究するために使用することができます。 HaloPROTAC3 は、HaloTag および HaloTag®融合ターゲットタンパク質に不可逆的に結合し、E3リガーゼコンポーネント(VHL)との結合を介してアクティブなE2 / E3ユビキチンリガーゼ複合体を動員し、ユビキチン化とそれに続くプロテアソームによる分解を引き起こします。

ent-HaloPROTAC3は、HaloPROTAC3の鏡像異性体の化合物であり、ネガティブコントロールとして機能します。 ent-HaloPROTAC3は、HaloPROTAC3 と同じ分子量と一般的な構造を持っていますが、d-ヒドロキシプロリンと d-バリン残基の修飾が含まれているため HaloTagには結合しますが、VHLとは結合しません。 ent-HaloPROTAC3 を使用して、HaloTag®融合タンパク質の分解が VHL エンゲージメントと PROTAC メカニズムによって媒介されることを確認することができます。

また、一過性のトランスフェクション発現および HaloPROTAC3 による分解実験に使用できる別売 のNanoLuc®-HaloTag® fusion vector, NanoBRET™ Positive Control(カタログ番号N1581)も提供しています。 この NanoBRET™ Positive Control の発光機能を使用すれば、抗体を使用せずにタンパク質分解を定量的に測定することができます(このオプションのプロトコルについては、テクニカルマニュアルを参照ください)。

HaloPROTAC3が標的タンパク質の分解を促進するしくみ

HaloPROTAC3は、クロロアルカン部分を介して34kDa HaloTag®タンパク質と不可逆的に相互作用し、HaloTag®融合タンパク質とVHLE3 リガーゼコンポーネントの間に三元複合体を形成します。この誘導された複合体は、HaloTag®自体のユビキチン化と、それに続くユビキチンプロテアソーム経路を介したHaloTag®融合タンパク質全体の分解を促進します。
How HaloPROTAC3 Promotes Target Degradation

タンパク質ノックアウト研究のための HaloPROTAC3 および HaloTag導入ゲノム編集細胞

HaloPROTAC3は、タンパク質ノックアウト研究で内在性の標的タンパク質を除去するために使用することができます。そのためには、CRISPR / Cas9 編集を使用してHaloTagをターゲット遺伝子に内在的にタグ付けする必要がある場合があります。 CRISPR編集細胞プールにおける HaloTag挿入の初期に認められる低効率を克服するには、蛍光 Janelia HaloTag®リガンドを利用して、FACS®ソーティング により HaloTag ノックイン ゲノム編集細胞を特異的に濃縮します。
HaloPROTAC3 removing endogenous target protein in protein knockout studies
内在性 HaloTag®融合は、ターゲット特異的 crRNA、精製されたCas9、およびターゲットタンパク質に対して500bpの相同性アームを両端に有するdsDNAプラスミドドナーベクターを使用した CRISPR / Cas9 ゲノム編集を使用して作成されます。 CRISPRで編集された細胞は、HaloTag®融合体に特異的に結合する蛍光HaloTag®リガンド、JaneliaFluor®646(カタログ番号GA1120、GA1121)で標識することができます。親細胞からのHaloTag®陽性細胞の濃縮とクローン選択は、FACS®ソーティングで行うことができます。

HaloTag®融合タンパク質の分解検出法

HaloTag®融合タンパク質は、標的タンパク質またはHaloTagのいずれかを認識する抗体を使用したウエスタンブロット分析(左パネル)、または HaloTag と11アミノ酸の HiBiTタグ(右パネル)を組み合わせることで検出することができます。 HiBiTはLgBiTタンパク質(細胞内で発現または溶解後に試薬として添加)に結合し、標的タンパク質レベルに比例した発光を生成します。

ウエスタンブロット検出法

Western blot analysis of HaloTag® fusion protein detection
NanoLuc-HaloTag を HEK293細胞で24時間発現させ、1µM の HaloPROTAC3、ent-HaloPROTAC3または等濃度のDMSOで処理した。24時間の処理後、モノクローナル HaloTag®抗体を使用して、ウエスタンブロットによりNanoLuc®-HaloTag®融合タンパク質を検出した。

HiBiT検出法

HaloTag® fusion protein detection by pairing with HiBiT
LgBiTタンパク質を安定発現する HEK293細胞の BRD4 N末端に HiBiT-HaloTag を CRISPR / Cas9 ゲノム編集によりノックインした。 HiBiT-HaloTag-BRD4 細胞をさまざまな濃度の HaloPROTAC3でそれぞれ3時間および24時間処理し、Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System(カタログ番号N3030、N3040、N3050)およびGloMax®Discover(カタログ番号GM3000)を用いた発光測定によりタンパク質分解を評価した。 

HaloPROTAC3 による HaloTag®融合タンパク質 の効率的な分解

この例では、HaloPROTAC3の添加により、Wnt3a刺激後にHaloTag-HiBiTを内在的にタグ付けした β-カテニンが効率的に分解されることを示しています。
Add HaloPROTAC3 for efficient degradation of tagged β-catenin
Nano-Glo®EndurazineSubstrate(カタログ番号N2570、N2571、N2572)を使用して24時間にわたってHiBiT発光を追跡することにより、LgBiTを安定発現するHEK293細胞での Wnt3a刺激後の β-カテニン-HaloTag-HiBiT レベルの増加を観察した。 Wnt3a 刺激 5時間後に1µM HaloPROTAC3 で処理すると、細胞内の位置に関係なく、ほとんどの β-カテニン-HaloTag-HiBiTが分解された。 

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プロトコール

製品仕様

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選択製品の構成品内容

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HaloPROTAC3, 2.5mM

GA311A 1 × 20μl

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パテントおよび免責条項

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Researcher may use this product for research use only; no transfer or commercial use of this product is allowed. Commercial use means any and all uses of this product by a party in exchange for consideration, including, but not limited to (1) use in further product manufacture; (2) use in provision of services, information or data; and (3) resale of the product or its derivatives, whether or not such product or derivatives are resold for use in research. With respect to any uses outside this label license, including any commercial, diagnostic, therapeutic or prophylactic uses, please contact Promega for supply and licensing information. PROMEGA MAKES NO REPRESENTATIONS OR WARRANTIES OF ANY KIND, EITHER EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING FOR MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE WITH REGARDS TO THE PRODUCT. The terms of this label license shall be governed under the laws of the State of Wisconsin, USA.

Licensed from Yale University under U.S. Pat. No. 10,730,862.

製品仕様

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選択製品の構成品内容

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ent-HaloPROTAC3, 2.5mM

GA411A 1 × 20μl

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