タンパク質：タンパク質 相互作用
タンパク質間の相互作用は膨大な数の生物学的プロセス（シグナル伝達経路で起こる瞬時の相互作用から巨大なタンパク質複合体形成にいたるまで）を調節しています。非常に明るく、サイズの小さな NanoLuc® ルシフェラーゼなら本来のタンパク質機能に影響を与えるリスクを最小限に抑えたタンパク質の標識や生理的条件下である生細胞内でタンパク質相互作用を検出することが可能です。NanoLuc® テクノロジーは、さらに生化学アッセイフォーマットにおけるタンパク質相互作用の高感度生物発光検出を可能にするために改良されました。
相補性を利用した NanoBiT® レポーターでタンパク質間相互作用を検出
リアルタイムでのタンパク質間相互作用の測定
NanoLuc® バイナリーテクノロジー (NanoBiT) は、生細胞内でタンパク質：タンパク質相互作用 (PPI) の検出に利用できる NanoLuc® ルシフェラーゼを2つのサブユニットに分けたシステムです。この NanoBiT® PPI システムは、Large BiT (LgBiT; 18kDa) と Small BiT (SmBiT; 1.3kDA) の2つの小さなサブユニットを利用し、それぞれPPIが予想される各標的タンパク質との融合タンパク質を発現させます。LgBiT および SmBiT サブユニットは安定性および最小限の自己会合性についてそれぞれに最適化されています。標的タンパク質が相互作用するとサブユニットの相補性により明るい発光酵素として再構成されます。
短期間 または 長期間 にわたりタンパク質間相互作用のダイナミクスをリアルタイムで測定するために Nano-Glo® Live Cell Detection System を提供しています。
Real-time monitoring of EGFR(1-673) dimerization following stimulation with increasing concentrations of EGF. The NanoBiT® EGFR(1-673) fusion constructs were stably expressed in U20S cells using the BiBiT bi-directional expression system.
Design Your Own: Use our NanoBiT® PPI Starter Systems to develop your own assay for studying target proteins of interest.
NanoBiT® 安定細胞株の構築
融合パートナーの一過性発現は多くのタンパク質相互作用実験で十分使用できますが、再現性を最大限に引き上げるために安定発現細胞株が必要な場合があります。この ポスターでは BiBiT-Ready ベクターによる安定発現細胞株の構築について記載されています。このアプローチにより ゲノムへのプラスミド DNAのランダムインテグレーション後、同じローカスから SmBiT および LgBiT 融合タンパク質が同レベル転写されます。
BRET ベースの NanoBRET™ Assay でタンパク質相互作用を測定
バックグラウンドが抑えられ、シグナルが増加した BRET アッセイ
アプリケーション例
LgBiTも細胞内で発現させている場合、CRISPR/CAS9ゲノム編集によりHiBiTタグを付加した内在性タンパク質は、BRETエネルギー供与体として使用することが可能です。HaloTag® 融合タンパク質は一過性に導入することができ、ネイティブな発現条件下で相互作用の動態を評価することができます。
ここでは、内在性タグ付加タンパク質であるHiBiT-BRD4が、特定のPROTAC処理に依存してユビキチン化レベルの増加速度が変化する例を紹介します。
NanoBRET™ PPI Assay のオプション
ご自身でアッセイをデザインされるか、様々な既成の NanoBRET™ PPI Assay （ブロモドメイン、その他のエピジェネティックタンパク質、転写関連タンパク質、シグナル伝達関連タンパク質、キナーゼ、膜タンパク質）からお選びいただけます。さらに、 三元複合体形成 や ターゲットタンパク質のユビキチン化 を測定する NanoBRET™ アッセイを開発するためのツールも用意されています。
自由にデザイン : NanoBRET™ PPI Starter system を用いて目的タンパク質を研究するための独自アッセイをデザインすることができます。
NanoBRET™ テクノロジーを用いた CRAF-BRAF 相互作用の検出
CRAF および BRAF タンパク質キナーゼはRas-Raf-MAPK パスウェイシグナル伝達内で機能し、腫瘍形成およびがんにおいて重要な役割を果たしています。この記事ではCRAF-BRAF ヘテロ二量体化のモニタリングのために NanoBRET™ テクノロジーを用いたタンパク質相互作用アッセイの開発について説明しています。
NanoBiT® 安定細胞株の構築
融合パートナーの一過性発現は多くのタンパク質相互作用実験で十分使用できますが、再現性を最大限に引き上げるために安定発現細胞株が必要な場合があります。この ポスターでは BiBiT-Ready ベクターによる安定発現細胞株の構築について記載されています。このアプローチにより ゲノムへのプラスミド DNAのランダムインテグレーション後、同じローカスから SmBiT および LgBiT 融合タンパク質が同レベル転写されます。
イムノアッセイフォーマットでタンパク質相互作用を測定
アッセイ原理. Lumit™ Anti-Tag PPI イムノアッセイは、免疫検出と NanoBiT® テクノロジーを組み合わせた精製タンパク質の 相互作用を測定するホモジニアス（洗浄不要）アッセイシステムです。Lumit™ PPIイムノアッセイでは、一般的に用いられるタグ 6His、GST、FLAG®、ヒトFcに対する抗体がLgBiTまたはSmBiTで標識されています。異なるタグを持つ 2 つのタンパク質が相互作用すると、SmBiT および LgBiT 標識抗体が反応します。これにより2 つの NanoBiT® サブユニットが結合し、活性型生物発光酵素が再構成されることによりタンパク質間の相互作用す検出することができます。
GTP 依存性 KRAS-cRAF 相互作用の検出
アッセイ原理 .KRASは、GTPまたは非加水分解性アナログGppNHpと結合すると、下流エフェクターであるcRAFと相互作用する。
Lumit™ PPI アッセイは、GTP結合状態のわずかな変化を検出するのに十分な感度を有しています。
