ApoTox-Glo™ Triplex Assay は、培養細胞を含む単一のウェルから細胞生存性/毒性/アポトーシスの各イベントについて容易に評価するための3つのアッセイケミストリを組合せたシステムです。まず最初に、2種類のペプチド基質を含む細胞非溶解性の試薬を加え、2つの異なるプロテアーゼバイオマーカーを同時に測定して生存性および毒性を決定します。生細胞プロテアーゼ活性はインタクトな生存細胞に限定され、細胞透過性の蛍光ペプチド基質（GF-AFC Substrate）で測定されます。この基質がインタクトな細胞に入ると、切断されて生細胞数に比例した蛍光シグナルを生じます。この生細胞活性マーカーは細胞膜が障害され培地に漏出すると不活性化されます。同時に、細胞非透過性の蛍光ペプチド基質（bis-AAF-R110 Substrate）は細胞膜の完全性が失われて外部に漏出した死細胞プロテアーゼ活性の測定に使用されます。この結果、レシオメトリック測定（比率測定）として細胞生存性と細胞毒性の値が逆相関することになります。生細胞と死細胞の比率は、細胞数とは独立した数値となり補正されたデータとして取り扱うことができます。2つめの試薬としてカスパーゼ3/7測定のための発光性DEVD-ペプチド基質と耐熱性組換えルシフェラーゼUltra-Glo™を添加します。カスパーゼ3/7による基質の切断でルシフェリンが遊離し、これがルシフェラーゼの基質となり発光を生じます。生じた光はルミノメーターで測定され、アポトーシスの主要なマーカーであるカスパーゼ3/7活性と相関します。
- 1ウェルより細胞生存性/毒性/アポトーシスを測定：1つのサンプルから細胞死のメカニズムを決定
- 簡便：シンプルな“添加-混和-測定”だけのプロトコル
- ビルトインコントロールによる補正されたデータ：生細胞数と死細胞数の比率は細胞数と独立した補正データで、ウェル間、プレート間、実験日間での比較が容易
- 柔軟で容易に自動化：添加する各アッセイ試薬の容量はスケールを自由に変えられるため多検体処理にマッチし、96や384プレートでの自動化も容易
- 効率化とコスト削減：1ウェルで3つのアッセイを行えるため細胞培養コストや人件費を削減可能
- 細胞死メカニズムの決定
- 細胞毒性リスクに備えた化合物ライブラリーのプロファイリング
Cat.# G6320 contains sufficient reagents for 100 assays in a 96-well plate format or 400 assays in a 384-well format. Cat.# G6321 contains sufficient reagents for 500 assays in a 96-well plate format or 2,000 assays in a 384-well format.
- Niles, A.L. et al. (2007) A homogeneous assay to measure live and dead cells in the same sample by detecting different protease markers. Anal. Biochem. 366, 197–206.
- O'Brien, M.A. et al. (2005) Homogeneous, bioluminescent protease assays: Caspase-3 as a model. J. Biomol. Screen. 10 137–48.
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