DNA・RNA定量
正確な核酸定量は、DNA・RNAサンプル調製ワークフローにおける重要なステップです。多くの場合、下流解析の成否は、適切な量と品質の核酸インプットを使用しているかどうかに左右されます。
プロメガのDNA・RNA定量製品には、ハンドヘルド型およびマイクロプレート対応のフルオロメーター、DNAまたはRNA濃度を蛍光法で測定するQuantiFluor®キット、そしてヒトおよびY染色体特異的DNAをqPCRベースで定量するPlexor® HYが含まれます。
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DNA定量・RNA定量の基礎
RNAおよびDNAの定量によく用いられる方法には、吸光度法、蛍光法、qPCR法があります。それぞれに利点と課題があり、どの方法を選択するかは、実験目的や下流で行うアッセイによって異なります。
吸光度定量法は導入しやすく、一般的な実験機器や試薬を使用できるシンプルな方法です。吸光度測定は、DNAが最も強く光を吸収する260nmで行い、得られた値から濃度を推定します。吸光度法は、操作が容易で検出レンジが広いという利点がありますが、蛍光法やqPCR法と比べると感度は低くなります。また、ssDNA、dsDNA、RNAを区別できず、260nmに吸収を持つ夾雑物が存在する場合は濃度を過大評価する可能性があります。
蛍光定量法は、dsDNA、ssDNA、またはRNAに結合する色素を使用します。色素が結合すると立体構造変化が生じ、励起により蛍光を発します。蛍光シグナルは核酸量に比例します。蛍光検出法は吸光度法より感度が高く、特にDNA濃度が低いサンプルに有効です。また、迅速で使いやすく、自動化ワークフローへの組み込みも容易です。
リアルタイムPCR（qPCR）では、蛍光レポーターを用いて、PCR増幅の各サイクル後に生成されたDNA産物の蓄積量を測定します。生成された増幅曲線は、蛍光シグナルをサイクル数に対してプロットしたもので、増幅産物の蓄積を示します。検出閾値とは、産物の蓄積をバックグラウンドから識別できる蛍光レベルのことです。増幅産物がこの検出閾値を超えるサイクル数を定量サイクル（Cq）といいます。サンプル中の標的DNA量が多いほど、Cq値は早いサイクルで現れます。qPCRベースの定量法の利点としては、高い感度と、マルチプレックス化によって1回の反応で複数のターゲットを検出できることが挙げられます。qPCRは増幅に基づく方法であるため、サンプルの増幅適性に関する情報も得られ、これはDNA品質の指標となります。
