CloneWeaver® Workflow Purchasing Tool

Alkaline Phosphatase,Calf Intestinal(CIAP)は、DNA,RNA,リボヌクレオシド三リン酸,デオキシリボヌクレオシド三リン酸から、5′-末端のリン酸基を加水分解します。青/白クローニングアッセイを用いた機能検定試験を行っています。

DNA Polymerase Iは、2本鎖DNAにおいてDNA鎖を5'→3'方向に合成します。多くのDNAポリメラーゼと同様に、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を示す“Proof Reader”です。また、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性も示すため、伸長中のDNA鎖でヌクレオチドを置換する機能を持ちます。
また、組換え大腸菌から精製された本酵素はホモポリマーのde novo合成を触媒するので、特定のDNA基質の調製に利用することもできます。

DNA Polymerase I Large(Klenow)FragmentはインタクトなE.coli DNA Polymerase Iから5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が欠如したDNAポリメラーゼです。5'→3'ポリメラーゼ活性、3'→5'エキソヌクレアーゼおよびストランド置換活性は保持しています。本酵素はDNA Polymerase IのC-末端断片で分子量は約68kDaです。Klenow Fragmentの5'→3'ポリメラーゼ活性は、5'突出末端の標識/未標識dNTPによるfill inや1本鎖または2本鎖DNAのシークエンシング、合成オリゴヌクレオチドを用いたin vitro変異導入、cDNA第2鎖合成、1本鎖DNAプローブの合成などに使用されます。また、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性は、3'突出末端の平滑化に利用されます。

Exonuclease IIIは2本鎖DNAに特異的な3′→5′エキソヌクレアーゼです。この酵素はニック、平滑末端、5′-突出末端あるいは3塩基以内の3′-突出末端の3′-OH側からモノヌクレオチドを段階的に除去し、ヌクレオシド-5′リン酸を生じます。また、内因性の3′-ホスファターゼ活性を持つため、3′-末端にリン酸基を持つDNAも分解します。さらにAPエンドヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼH活性も有します。Exonuclease IIIはS1nucleaseと組合わせてDNA断片を1方向から削除する場合に使用されます。

Flexi Cloning Systemは、2つのレアカッター制限酵素SgfIおよびPmeIを利用したシンプルで強力なディレクショナルクローニングシステムです。これらのシステムにより、様々なFlexi®Vector間におけるタンパク質コード配列を迅速で効率よく正確に移し換えることができます。全てのFlexi®Vectorには致死性のバーナーゼ遺伝子が組み込まれており、目的とするDNA断片との置換によりポジティブセレクションが行えます。一度 Flexi®Vectorにクローニングされれば、他の機能を有するFlexi®Vectorにサブクローニングする際もSgfIおよびPmeIで切り出すことにより方向性、読み枠を維持したまま移すことができ、確認のために再度シークエンシングを行う必要がなくハイスループットフォーマットにも対応します。部位特異的な組換えベクターシステムとは異なり、目的タンパク質のN,C末端に複数の余分なアミノ酸を付加する必要が無く(C末端のValのみ)、保存用のエントリーベクターも不要で、通常、実験に適したFlexi®Vectorに直接組み込むことができます。
C-terminal Flexi®Vector（pFCで始まるベクター）はC末端にタグを持つタンパク質を発現します。両端にSgfIおよびPmeIを持つタンパク質コード領域をSgfIおよびEcoICRIで切断したこれらのベクターに組換えることができます（ただし、C-terminal Flexi®Vectorにクローニングしたインサートは他のFlexi®ベクターへの移換えは不能）。

LigaFast™ Rapid DNA Ligation Systemは突出（粘着）末端を持つDNAインサートをたったの5分（平滑末端ならば15分）でプラスミドにライゲーションすることができるキットです。T4DNA Ligaseとユニークな2X Rapid Ligation Bufferを組合せています。連結されたDNAはトランスフォーメーションをする前に精製する必要がありません。また、特製の2X Rapid Ligation Bufferは使用前にATPやMg2+を加える必要はありません。

pUC/M13Primersは、Messingにより開発されたpUCベクターやM13ベクターにクローニングされたDNAのシークエンシングに使用します。プロメガのpGEM(R)-Z VectorやpGEM(R)-Zf Vectorのような、lacZ遺伝子を含むプラスミドにも使用できます。ゲル電気泳動法で精製され、シークエンス反応で検定されています。

保存バッファー：滅菌水

Ribonuclease H(RNase H)は、DNAとハイブリダイズしているRNAのホスホジエステル結合を特異的に加水分解し、3′-末端に水酸基と5′-末端にリン酸基を持つ分解産物を生成するエンドリボヌクレアーゼです。ただし、1本鎖の核酸,2本鎖DNA,2本鎖RNAは消化しません。

RNase ONE™ Ribonucleaseは、E.coli由来の分子量27,000Daのペリプラズム酵素で、RNAを分解し、中間体としてサイクリックヌクレオチド1リン酸(cNMP)を生成します。さらにこの中間体からヌクレオチド1リン酸(3′-NMP)に分解しますが、この反応はゆっくり進行します。また、4種類の塩基すべてのホスホジエステル結合を解裂できる数少ないリボヌクレアーゼの1つです。過剰産生クローンから高純度に精製されるため、DNA基質に対するエンドヌクレアーゼ,エキソヌクレアーゼ活性は完全に排除されています。そのため、市販のDNase-free Rnaseの代用として、煮沸などの前処理を行わずに使用できます。

RQ1RNase-Free DNaseは、高純度に精製されたDNase I製品で、1本鎖あるいは2本鎖DNAを分解して3'-末端に水酸基を持つオリゴヌクレオチドを生成します。特にRNAの保護が必須である実験系で使用されます。RNase活性が全く検出されないことを、酵素処理後のRNA,DNA混合溶液のゲル解析法を含む2種類の方法で確認しています。

S1Nucleaseは、1本鎖DNA,RNAをエンドヌクレアーゼ様に分解し、5′-末端にリン酸基を持つ分解産物を生成します。極めて高濃度な場合を除き、2本鎖核酸(DNA:DNA,DNA:RNA,RNA:RNA)には作用しません。

E.coliのSingle-Stranded DNA Binding Protein(SSB)は、分子量18.9kDaの単一サブユニットから構成される四量体です。1本鎖DNAとの親和性が高く、SSBが協同的に結合しますが、2本鎖DNAにはほとんど結合しません。in vivoのDNA複製や組換えに関与するタンパク質です。

SP6RNA Polymeraseは、DNA依存性RNAポリメラーゼで、各プロモーター配列に極めて高い特異性を示します。
保存バッファー：20mM potassium phosphate buffer(pH7.7at25 ℃),1mM EDTA,10mM DTT,100mM NaCl,0.1%(v/v)Triton®X-100,50%(v/v)glycerol.

SP6PrimerとT7Primerは、pGEM®やLambda GEM®VectorsなどにクローニングされたDNAのシークエンシングに使用します。これらプライマーは、1本鎖DNAあるいはアルカリ変性2本鎖DNAとアニールします。プロモータープライマーはゲル電気泳動法またはHPLCで精製され、シークエンス反応で検定されています。T7EEV Primerは、哺乳動物発現ベクターであるpALTER®-MAX VectorやpClシリーズのシークエンシングに最適です。

T3RNA Polymeraseは、DNA依存性RNAポリメラーゼで、各プロモーター配列に極めて高い特異性を示します。

保存バッファー：20mM potassium phosphate buffer(pH7.7at25 ℃),1mM EDTA,10mM DTT,100mM NaCl,0.1%(v/v)Triton®X-100,50%(v/v)glycerol.

2本鎖DNAの平滑末端あるいは適合する付着末端の、5'-末端のリン酸基と3'末端の水酸基を連結します。2本鎖であればRNA:DNAおよびRNA:RNAも連結しますが、1本鎖ヌクレオチドは連結しません。青/白クローニングアッセイを用いて、T4DNA Ligaseの機能を検定しています。

T4DNA Polymeraseは、1本鎖DNAテンプレートに結合したプライマーから5'→3'方向にDNAを合成します。強力な3'→5'エキソヌクレアーゼ活性（proofreading）を示しますが、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性はありません。

T4Polynucleotide Kinaseは、ATPのγ-リン酸基をポリヌクレオチドの5'-末端あるいは5'-末端のリン酸基を持つモノヌクレオチドに転移する反応を触媒します。ライゲーション前のRNA,DNAおよび合成ヌクレオチドのリン酸化等に使用されます。

ユニットの定義：1ユニットは、37℃,30分間で1nmolリン酸を[γ-32P]ATPからオリゴヌクレオチド5'-OH基へ転移するために必要な酵素量です。反応溶液として40mM Tris-HCl(pH7.5at25℃),10mM MgCl2,5mM DTT,0.1mM[γ-32P]ATPを使用し、基質として0.5 mMの5'-OHポリヌクレオチドを使用しました。

品質検査法：活性試験、DNase/RNase試験、エンドヌクレアーゼ、エンドラベリング、青/白クローニング試験

T4RNA Ligaseは、ATPに依存して、1本鎖RNAまたはDNAの分子間および分子内の連結を行い、1本鎖RNAまたはDNAの5′-末端のリン酸基と3′-末端の水酸基を結合します。同様に、1本鎖RNAに[5′-32P]nucleoside3′,5′-bis(phosphate)を付加する反応も行います。本酵素はRNase Iを欠如する組換えE.coli CA4株から精製しており、分子量は約43.5KDaです。

ユニットの定義：1ユニットは、37℃,30分間,30µl反応溶液中で1nmolの[5′-32P]rA14-20をホスファターゼ耐性に変換する反応を行うために必要な酵素量です。反応溶液として50mMTris-HCl(pH7.8at25℃),10mM MgCl2,5mM DTT,1mM ATPを使用し、基質としては10µM[5′-32P]rA14-20を使用しました。

Terminal deoxynucleotidyl TransferaseはDNAの3′-末端OH基への連続するdNTPの付加反応を触媒し、それにともない無機リン酸を放出します。この反応によりユニークなDNA3'-エンドラベリングが行えます。重合反応は鋳型に依存しませんが、イニシエーターとしては1本鎖DNAが好適です。2本鎖DNAイニシエーターの中で3'-突出末端を持つDNAが最も効率良くテーリングされます。本酵素は43kDaの単一タンパク質として90%以上の純度を示します。